Il n’existe malheureusement pas de test permettant de confirmer ou d’exclure une SEP avec une totale certitude. Le diagnostic est posé sur la base d'une conjonction de différents éléments. Le récit du patient tout comme l’examen neurologique livrent des informations qui peuvent témoigner d’une propagation des lésions dans le SNC, à la fois dans le temps et dans l’espace. Il s’agit d’une condition nécessaire au diagnostic (critères McDonald). Des examens complémentaires peuvent consister en une analyse du liquide cérébrospinal (LCS), une exploration électrophysiologique et surtout une IRM.

Les techniques d’imagerie médicale - imagerie par résonance magnétique (IRM) du cerveau et de la moelle épinière - permettent de voir clairement les lésions de la substance blanche. Elles ont une apparence assez caractéristique en cas de SEP. L’analyse du LCS, obtenu par ponction lombaire, montre des signes d’inflammation typiquement modérés. Les analyses sanguines sont en général normales. D’autres maladies chroniques du système immunitaire et des infections du LCS doivent être autant que possible exclues.

Une première poussée avec indication d’une SEP est appelée syndrome clinique isolé (SCI). En théorie, il peut encore s’agir ici d’une réaction postinfectieuse unique (réaction erronée du système immunitaire après contact avec un virus ou une bactérie). On appelle syndrome radiologiquement isolé  ( radiologically isolated syndrome  - RIS) la découverte radiologique fortuite de lésions suggestives de SEP sans corrélat clinique.